细胞上清代谢组学前处理关键步骤有哪些？

核心原则与挑战

• 挑战1：高盐与培养基残留

  细胞培养基（如DMEM、RPMI-1640）含有高浓度的盐（Na⁺, K⁺, PO₄³⁻）、氨基酸、维生素和缓冲剂（如HEPES），这些成分会严重干扰色谱分离和质谱检测，并抑制离子化效率。

• 挑战2：蛋白质干扰

  培养基中含有大量血清蛋白（如胎牛血清），以及细胞分泌的蛋白质，这些蛋白质会污染色谱柱，堵塞质谱离子源，并导致代谢物吸附损失。

  
• 挑战3：代谢物多样性

  代谢物种类繁多,极性、分子量、稳定性差异巨大，需要一种广谱的提取方法来捕获尽可能多的代谢物。

• 挑战4：动态范围广

  代谢物浓度跨度极大,从纳摩尔级到毫摩尔级，前处理过程需要兼顾高丰度和低丰度代谢物的准确定量。

通用前处理流程（以LC-MS为例）

这是一个经典且通用的流程,可以根据具体分析目的进行微调。

步骤1：样品采集与预处理

1. 收集上清：

   
   • 在预定的时间点（如药物处理前后），小心吸取细胞培养上清。
   • 关键： 动作要轻柔，避免吸起细胞沉淀。
   • 快速操作： 为防止代谢物发生酶促或非酶促变化，整个过程应尽可能在冰上进行。

2. 去除细胞碎片：

   • 将收集的上清在 4°C 下，以 低速离心（通常为 500-2000 × g，5-10分钟）。
   • 目的是去除因操作或细胞死亡脱落的细胞碎片和少量完整的细胞。
   • 小心： 转速过高可能会沉淀一些小分子代谢物，导致结果偏低。

3. （可选）去除血清蛋白：

   • 如果实验设计要求分析细胞自身分泌的代谢物，而非培养基中固有的代谢物，这一步至关重要。
   • 常用方法：
     • 超滤： 使用特定截留分子量（如3 kDa或10 kDa）的超滤管，在4°C下离心，这能有效去除大分子蛋白质，同时保留小分子代谢物，这是最常用且温和的方法。
     • 沉淀法： 加入有机溶剂（如甲醇、乙腈）或酸（如三氯乙酸）使蛋白质沉淀，然后离心取上清，此法操作简单，但可能导致某些极性代谢物共沉淀而损失，且引入的酸或盐可能影响后续分析。

步骤2：代谢物提取（Quenching & Extraction）

这是前处理的核心,目的是“冻结”细胞代谢状态，并高效地提取代谢物。

1. 代谢淬灭 - Quenching:

   
   • 目的： 瞬间终止细胞内所有酶的活性，防止代谢物在收集和后续处理过程中继续变化。
   • 方法：
     • 冷甲醇淬灭： 将预冷至-40°C的甲醇溶液（如60%或80%甲醇水溶液）快速加入到等体积或一定比例的冰冷的细胞上清中，这是最常用的方法，能快速降温并使蛋白质变性。
     • 冷溶剂淬灭： 使用预冷的乙腈、丙酮或甲醇-乙腈混合物。
   • 操作： 加入淬灭溶剂后，需立即涡旋混匀，并在冰上孵育一段时间（如5-10分钟），确保淬灭完全。

2. 代谢物提取 - Extraction:

   • 目的： 从复杂的基质中最大限度地分离出目标代谢物。
   • 常用溶剂体系（广谱提取）：
     • 甲醇/水/氯仿: 经典的Bligh-Dyer法，能有效提取极性（水相）和非极性（有机相）代谢物，适合脂质组学和广泛代谢物分析。
     • 甲醇/乙腈/水: 这是目前代谢组学中最主流的提取体系，通常使用比例为40:40:20（甲醇:乙腈:水）或类似的组合，此体系蛋白沉淀效果好，代谢物回收率高，且与 reversed-phase LC-MS 兼容性好。
   • 操作：
     • 将淬灭后的样品涡旋混匀。
     • 在4°C下进行 高速离心（通常为 12,000-16,000 × g，10-15分钟）。
     • 离心后,样品会分层（如使用氯仿）或形成蛋白沉淀，小心吸取上清液（或特定层）至新的EP管中。

步骤3：样品浓缩与干燥

1. 去除提取溶剂：

   • 将上清液进行真空浓缩干燥,常用设备为 SpeedVac（真空离心浓缩仪）。
   • 关键： 温度应设置在较低水平（如30-40°C），避免高温导致热不稳定的代谢物（如ATP、辅酶A等）降解。

2. 复溶:

   • 用与后续分析仪器兼容的溶剂（如初始流动相，如水/乙腈 = 95:5，含0.1%甲酸铵）重新溶解干燥的代谢物提取物。
   • 关键：
     • 溶剂选择： 必须保证代谢物完全溶解，避免沉淀。
     • 体积一致： 所有样品的复溶体积必须严格一致，以保证浓度可比性。
     • 涡旋与超声： 复溶后需充分涡旋，必要时可进行短时间超声助溶，确保样品均一。

步骤4：质控样品与内标

• 质控样品： 将等量的所有待测样品混合，制成一个“QC”（Quality Control）样品，在分析序列中，每隔5-10个样品插入一个QC，QC样品的色谱峰应高度重现，用于监控整个分析过程的稳定性和仪器状态。
• 内标： 在样品提取的早期阶段（如淬灭时或淬灭后）加入结构类似但自然界中不存在的稳定同位素标记的内标，内标可以校正样品前处理过程中的损失、基质效应和仪器信号漂移，是保证定量的准确性的关键，内标的选择应覆盖不同种类和极性的代谢物。

针对不同分析平台的方案调整

液相色谱-质谱联用

• 正/反相色谱：
  • Reversed-Phase (C18柱): 适合分析中等非极性到非极性代谢物（如脂质、部分氨基酸、有机酸），常用提取溶剂为甲醇/乙腈/水。
  • Hydrophilic Interaction Chromatography (HILIC柱): 适合分析强极性代谢物（如氨基酸、糖类、核苷酸、有机酸），常用提取溶剂为乙腈/甲醇。
• 质谱模式：
  • 高分辨质谱: 如Q-TOF, Orbitrap，前处理要求更高，需特别注意盐分和基质效应，避免影响高分辨率的准确质量测定。
  • 三重四极杆质谱: 用于靶向定量，对前处理的要求相对宽松，但基质效应会影响定量准确性，因此内标的使用至关重要。

气相色谱-质谱联用

• 特殊要求： GC-MS要求样品是挥发性或可衍生化的。
• 前处理调整：
  1. 提取： 通常使用单一有机溶剂（如甲醇）进行提取和沉淀。
  2. 干燥： 必须彻底干燥，去除所有水分。
  3. 衍生化: 这是GC-MS前处理最关键的一步，需要将极性代谢物（如有机酸、糖、氨基酸）通过甲硅烷化（如BSTFA）或酰化反应，增加其挥热稳定性和挥发性，衍生化过程需要严格控制时间和温度。

核磁共振

• 特殊要求： NMR对样品的盐分和pH极其敏感，高盐分会严重干扰信号，导致谱线增宽、基线抬高。
• 前处理调整：
  1. 除盐： 必须进行高效的除盐操作，常用方法包括：
     • 固相萃取: 使用专用的混合型阳离子/阴离子交换柱。
     • 超滤: 使用低截留分子量的超滤膜（如1 kDa）。
  2. 冻干-重溶: 是除盐和浓缩的经典方法，将样品冻干后，用重水（D₂O）和缓冲液（如磷酸盐缓冲液，pD 7.4）重新溶解，并加入化学位移参考物（如TSP或TSP-d4）。

关键注意事项与最佳实践

1. 记录一切： 详细记录所有操作步骤、时间、温度、试剂批号、离心参数等，这是结果可重复性的基础。
2. 使用冰水浴： 从样品收集到淬灭，全程在冰上操作，最大限度地保持代谢物原位状态。
3. 避免冻融循环： 样品应分装后于-80°C保存，避免反复冻融导致代谢物降解。
4. 设置生物学重复： 每个实验组至少设置3-5个生物学重复，以获得可靠的统计学结论。
5. 做空白对照： 设置只加培养基、不加细胞的“空白培养基”对照，用于扣除培养基中原有代谢物的背景信号。
6. 方法学验证： 如果进行靶向定量，需要对方法的线性范围、精密度、准确度、回收率、基质效应等进行验证。

总结流程图

graph TD
    A[细胞培养] --> B{预定时间点};
    B --> C[冰上小心吸取上清];
    C --> D[4°C, 500-2000 g, 离心去除细胞碎片];
    D --> E{是否去除血清蛋白?};
    E -- 是 --> F[超滤/沉淀法];
    E -- 否 --> G[直接进入下一步];
    F --> G;
    G --> H[加入预冷淬灭溶剂 (e.g., -40°C MeOH)];
    H --> I[涡旋混匀, 冰上孵育];
    I --> J[加入提取溶剂 (e.g., MeOH:ACN:H₂O)];
    J --> K[涡旋混匀, 充分提取];
    K --> L[4°C, 12,000-16,000 g, 高速离心];
    L --> M[小心吸取上清];
    M --> N{分析平台?};
    N -- LC-MS --> O[真空干燥];
    N -- GC-MS --> O;
    N -- NMR --> P[高效除盐];
    P --> Q[冻干];
    O --> R[用初始流动相复溶];
    Q --> R;
    R --> S[涡旋/超声, 混匀];
    S --> T[LC-MS/GC-MS/NMR 分析];

遵循以上规范化的流程,可以最大限度地保证细胞上清代谢组学数据的质量，为后续的生物信息学分析和生物学意义的解读奠定坚实的基础。

标签： 组分分离 质谱分析